ELISA
26. 2. 2007
Elisa (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) je biochemická metoda užívaná v imunologii k detekci přítomnosti (a také ke stanovení) určité protilátky či antigenu ve vzorku.
Metoda je založena na vysoce specifické interakci protilátky a antigenu. Existuje mnoho způsobů, jak provést tento test, ovšem všechny mají společné to, že protilátka s kovalentně navázaným enzymem (proto název "enzyme-linked") specificky rozeznává a váže se na cílový antigen. Je-li tento antigen přítomen, vzniká komplex (antigen)+(protilátka+vázaný enzym) a enzymová část tohoto komplexu katalyzuje reakci substrátu, který se poté přidá do reakční směsi - vzniklý produkt je buď barevný (stanovuje se spektrofotometricky) anebo fluoreskující (stanovuje se fluorimetricky).
Jak už název dále napovídá ("Sorbent"), další charakteristikou ELISA je i zakotvení protilátky anebo antigenu na nerozpustný nosič (ať už opět kovalentně nebo adsorpcí). Toto zakotvení značně ulehčuje separaci a promývání navázaných molekul (stejně jako i v jiných případech, kdy se používá kotvení na pevné fázi).
Protože imunochemické reakce jsou dosti citlivé, je možné touto metodou detekovat množství proteinů menší než nanogram. Použité protilátky mohou být buď monoklonální či polyklonální; použití monoklonálních látek ovšem poskytuje více věrohodné výsledky.
ELISA má dva základní typy provedení - nepřímá ELISA a sandwichová ELISA.
1. nepřímá ELISA: používá se pro detekci přítomnosti protilátky a je např. základem pro test na nákazu virem HIV. Test se provádí tak, že se antigeny (proteiny virového obalu) adsorbují na dno reakční nádobky, poté se přidají pacientovy protilátky a nechají se vázat na antigen. Nakonec se přidají protilátky proti lidským protilátkám s navázaným enzymem (např. kozí protilátky, které rozpoznávají lidské protilátky), které se váží na komplex antigen-protilátka. Poté se vymyjí nenávazané protilátky, aplikuje se substrát a proběhne-li enzymová reakce, je zřejmé, že se na lidské protilátky navázaly protilátky s navázaným enzymem (kozí), což dále znamená, že pacient měl protilátky proti virovému antigenu.
2. sandwichová ELISA: umožňuje jednak detekci, tak i kvantitativní stanovení antigenu. Postupuje se tak, že se nejprve adsorbuje protilátka proti určitému antigenu na dno reakční nádobky, následně se přidá antigen, který se váže na protilátku. Nakonec se přidá druhá (rozdílná) protilátka k antigenu. tato druhá protilátka je opět spojena s enzymem a další průběh je analogický tomu u nepřímé ELISA. Rozsah proběhnuvší enzymové reakce je poté přímo úměrný množství přítomného antigenu. Tato metoda umožňuje měření malých množství antigenu.
Metoda je založena na vysoce specifické interakci protilátky a antigenu. Existuje mnoho způsobů, jak provést tento test, ovšem všechny mají společné to, že protilátka s kovalentně navázaným enzymem (proto název "enzyme-linked") specificky rozeznává a váže se na cílový antigen. Je-li tento antigen přítomen, vzniká komplex (antigen)+(protilátka+vázaný enzym) a enzymová část tohoto komplexu katalyzuje reakci substrátu, který se poté přidá do reakční směsi - vzniklý produkt je buď barevný (stanovuje se spektrofotometricky) anebo fluoreskující (stanovuje se fluorimetricky).
Jak už název dále napovídá ("Sorbent"), další charakteristikou ELISA je i zakotvení protilátky anebo antigenu na nerozpustný nosič (ať už opět kovalentně nebo adsorpcí). Toto zakotvení značně ulehčuje separaci a promývání navázaných molekul (stejně jako i v jiných případech, kdy se používá kotvení na pevné fázi).
Protože imunochemické reakce jsou dosti citlivé, je možné touto metodou detekovat množství proteinů menší než nanogram. Použité protilátky mohou být buď monoklonální či polyklonální; použití monoklonálních látek ovšem poskytuje více věrohodné výsledky.
ELISA má dva základní typy provedení - nepřímá ELISA a sandwichová ELISA.
1. nepřímá ELISA: používá se pro detekci přítomnosti protilátky a je např. základem pro test na nákazu virem HIV. Test se provádí tak, že se antigeny (proteiny virového obalu) adsorbují na dno reakční nádobky, poté se přidají pacientovy protilátky a nechají se vázat na antigen. Nakonec se přidají protilátky proti lidským protilátkám s navázaným enzymem (např. kozí protilátky, které rozpoznávají lidské protilátky), které se váží na komplex antigen-protilátka. Poté se vymyjí nenávazané protilátky, aplikuje se substrát a proběhne-li enzymová reakce, je zřejmé, že se na lidské protilátky navázaly protilátky s navázaným enzymem (kozí), což dále znamená, že pacient měl protilátky proti virovému antigenu.
2. sandwichová ELISA: umožňuje jednak detekci, tak i kvantitativní stanovení antigenu. Postupuje se tak, že se nejprve adsorbuje protilátka proti určitému antigenu na dno reakční nádobky, následně se přidá antigen, který se váže na protilátku. Nakonec se přidá druhá (rozdílná) protilátka k antigenu. tato druhá protilátka je opět spojena s enzymem a další průběh je analogický tomu u nepřímé ELISA. Rozsah proběhnuvší enzymové reakce je poté přímo úměrný množství přítomného antigenu. Tato metoda umožňuje měření malých množství antigenu.
Komentáře
Přehled komentářů
Zatím nebyl vložen žádný komentář